一、 原理? 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等**样本中的SEM，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免*化学反应的原理来进行的，样本中的SEM和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃西林代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的SEM含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物含量。 ? 二、 试剂盒技术指标： 试剂盒灵敏度：? 0.1 ppb 样本检测下限： **、蜂蜜 ????? 0.2 ppb 鱼/虾等水产品**因存在一定的干扰，检测下限为0.3 ppb 回收率： 鱼/虾水产**? ?????? 85％±10％ 蜂蜜/鸡肉/肝脏样本??? 75％±15％ 交叉反应率： 呋喃西林代谢物? ????? 100％ 呋喃它酮代谢物? ??????0.1％ 呋喃妥因代谢物? ??????0.1％ 呋喃唑酮代谢物? ??????0.1％ ? 三、试剂盒组成 1．微量测试孔：??  96T/8孔 2．标准液：??????? 0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb （1ml/瓶） 3．酶标记物：? ????? 12 mL 4．抗体浓缩液：?? ??? 7 mL 5．底物缓冲液：? ???? 7 mL 6．底物液：?????????? 7 mL 7．终止液：??? ?????? 7 mL 8．20倍浓缩洗涤液 ：50 mL ? 9．复溶液：????????? 50 mL  10．15.1 mg衍生化试剂 ? 四、 所用仪器、试剂 具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01 g） 微量移液器：单道20 μL-200 μL，100 μL-1000 μL、多道250 μL 试?????? 剂：氢氧化钠、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、甲醇、乙酸乙酯、亚硝基铁**钾（K2Fe（CN）5?NO?3H2O）ZnSO4?7H2O ? 五、样本前处理步骤 样本处理前须知 处理任何样本时，都必须注意： （a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理需配制： 1．衍生化试剂 称15.1 mg邻硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(浓度10 mM) 2．C液：（供奶样用）称12.5 g亚硝基铁**钾用去离子水定溶至100 mL。 ??????? D液：（供奶样用）称29.8 g **锌用去离子水溶解定溶至100 mL。 3．0.1 MK2HPO4?称22.8 g K2HPO4?3H2O??? 加去离子水溶解定溶至1 L 4．1 M HCl取8.6 mL浓HCl加水定溶至100 mL。 5．1 M NaOH称取4 g NaOH加水定溶至100 mL。 ? 样本的处理 (a)?肉样或鱼虾 用均质器均质样本,接（d）的描述方法 ? (b)?奶样 1．取出5 mL的奶样本到玻璃离心管中，分别加入C液和D液各250 μL。 2．用振荡器充分混合样本，用恒温离心机4000 r/min以上离心10 min(4-12 ℃).若没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8 ℃,然后离心。 3．接(d)的描述方法。 ? (c)?蜂蜜? 1．取1±0.05 g样本到离心管中。 2．加入4 mL的去离子水溶解,再加入0.5 mL1 M HCl和100 μL衍生化试剂,充分振荡。 3．接(d)第2步描述方法。 ? (d)接上面的方法 1．取1±0.05 g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛奶的离心上清液1.1 mL（相当1 mL奶样），分别加入4 mL的去离子水，0.5 mL 1 M HCl和100 μL衍生化试剂，充分振荡。 2．置于56 ℃过夜孵育（大约2 h）。 3．分别加入5 mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1M NaOH和5 mL的乙酸乙酯，充分振荡30 s； 4．在室温下（20-25 ℃）4000 r/min以上离心10 min。 5．取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50 ℃氮气/空气吹干。 ? 6．用1 mL正己烷溶解干燥物，用1mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温下（20-25 ℃） 4000 r/min以上离心10 min。 7．取50 μL下层相用于分析。 ? 样本稀释倍数：2 ? 六、实验操作步骤 ? 1．将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2．按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷冻。 3．加标准品/样本50 μL /孔，然后加入抗体工作液50 μL/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，室温反应30 min。 4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5．加入酶标记物100μl /孔，用封板膜盖板，室温反应20 min。 6．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 7．显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL，轻轻振荡混匀，室温环境避光显色10 min。 8．测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处（在20 min内读完数据），测定吸光度值。 七、结果判定 以标准品百分吸光率为纵坐标，以SEM标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。 ? 八、注意事项 １．用前将所有试剂温度回升至室温20-25 ℃。 ２．用之后立即将所有试剂放回2-8 ℃冰箱。 ３．在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的?????? 洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。 ４. 所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。 ５．试剂及标本没有回到室温（20-25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。 ６．在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性?????? 不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。　　 ７. 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。 8.? 反应终止液为2 M**，避免接触皮肤。 9.? 不要使用过了有效日期的试剂盒，会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中的试剂。 10.? 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 11.? 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。 ? 九、储藏条件和保质期 储藏条件：试剂盒于2-8 ℃保存，不要冷冻。 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。