一、 原理? 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等**样本中的AMOZ，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免*化学反应的原理来进行的，样本中的AMOZ和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃它酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的AMOZ含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出呋喃它酮代谢物含量。 ? 二、 试剂盒技术指标： 试剂盒灵敏度：??0.1 ppb 样本检测下限： **、蜂蜜???????? 0.2 ppb 鱼/虾等水产品**因存在一定的干扰，检测下限为0.3 ppb 回收率： 鱼/虾水产**?? ??? 90％±15％ 蜂蜜/鸡肉/肝脏样本? 80％±15％ 交叉反应率： 呋喃它酮代谢物 ???? 100％ 呋喃唑酮代谢物 ?????0.1％ 呋喃妥因代谢物???? ?0.1％ 呋喃西林代谢物???? ?0.1％ ? 三、试剂盒组成 1．微量测试孔：96T/8孔 2．标准品液： 0 ppb? 0.1 ppb? 0.3 ppb? 0.9 ppb? 2.7 ppb? 8.1 ppb （1ml/瓶） 3．酶标记物???????????? ?? 12ml 4．抗体工作液????????????? 7ml 5．底物缓冲液????????????? 7 ml 6．底物液????????????????? 7 ml 7．终止液????????????????? 7 ml 8．20倍浓缩洗涤液???????? 50 ml 9．复溶液 ???????????????? 50 ml 10．15.1 mg衍生化试剂 ? 四、 所用仪器、试剂 具备的仪器：? 微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g） 微量移液器：? 单道20μl-200μl，100μl-1000μl、多道250μl 试?????? 剂：? 甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾、邻硝基苯甲醛、亚硝基铁**钾（K2Fe（CN）5?NO?3H2O）ZnSO4?7H2O ? 五、样本前处理步骤 样本处理前须知 处理任何样本时，都必须注意： （a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。 样本前处理需配制： 1．衍生化试剂 称15.1 mg邻硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(浓度10 mM) 2．C液：（供奶样用）称12.5 g亚硝基铁**钾用去离子水定溶至100 mL。 ?? ?? D液：（供奶样用）称29.8 g **锌用去离子水溶解定溶至100 mL。 3．0.1 M K2HPO4?称22.8 g K2HPO4?3H2O 加去离子水溶解定溶至1 L 4．1M HCl取8.6 ml浓HCl加水定溶至100 mL。 5．1M NaOH称取4 g NaOH加水定溶至100 mL。 样本的处理 (a)?肉样或鱼虾 用均质器均质样本，接（d）的描述方法 (b)?奶样 1. 取出5 mL的奶样本到玻璃离心管中，分别加入C液和D液各250 μL。 2. 用振荡器充分混合样本,用恒温离心机4000 r/min以上离心10 min(4-12 ℃).若没有恒温离心机,则先将样本降温至大约8 ℃，然后离心。 3. 接(d)的描述方法 (c)?蜂蜜? 1. 取1±0.05 g样本到离心管中。 2. 加入4 mL的去离子水溶解，再加入0.5 mL 1 M HCl和100 μL衍生化试剂,充分振荡。 3. 接(d)第2步描述方法 (d)接上面的方法 1. 取1±0.05 g的均质样本(肉样/鱼虾)、牛奶的离心上清液1.1 mL（相当1 mL奶样），分别加入4 mL的去离子水，0.5 mL 1 M HCl和100 μL衍生化试剂，充分振荡。 2. 置于56 ℃环境中孵育（2 h）。 3. 分别加入5 mL 0.1 M K2HPO4， 0.4 mL1 M NaOH和5 mL的乙酸乙酯，充分振荡30 s。 4. 在室温下（20-25 ℃）4000 r/min以上离心10 min。 5. 取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一洁净容器中于50 ℃氮气/空气吹干。 ??? 6. 用1 mL正己烷溶解干燥物，用1mL已稀释好的复溶液充分混合；在室温下（20-25 ℃）4000 r/min以上离心10 min。 7. 取50μl下层相用于分析。 样本稀释倍数：2 ? 六、操作步骤 1． 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2． 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷冻。 3． 加标准品/样本50 μL /孔，然后加入抗体工作液50 μL/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，室温反应30 min。 4． 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5． 加入酶标记物100 μL/孔，用封板膜盖板，室温反应20 min。 6． 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 ?? 7．显色：每孔加入底物缓冲液50μl，再加底物液50μl，轻轻振荡混匀，室温环境下避光显色10min。 8．测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450nm处（在20min内读完数据），测定吸光度值。 ? 七、结果判定 以标准品百分吸光率为纵坐标，以AMOZ标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AMOZ实际浓度。 ? 八、注意事项 1．室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20-25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。 2．洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。 4．反应终止液为2 M**，避免接触皮肤。 5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。 7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.6时，表示试剂可能变质。 8．该试剂盒比较好反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 ? 九、储藏条件和保质期 储藏条件：试剂盒于2-8 ℃保存，不要冷冻。 保质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒