一、原理 本试剂盒采用固相酶联免*吸附ELISA原理，通过黄曲霉***B1(AFB1)抗原和曲霉***B1(AFB1)抗体，待测抗原的竞争免*反应，以及酶的催化显色反应来检测AFB1，***是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读，适用于食品、饲料及相关原料中AFB1的定量检测。?? ? 二、试剂盒技术指标 试剂盒灵敏度：0.1 ppb 回收率：??谷物/饲料中AFB1回收率?? 95％±15％ 变异系数：批内变异系数<10％，批间变异系数<15％。 ? 三、试剂盒 组 成 1．微量测试孔：? 96T/8孔 2．标 准 液×6瓶：（1 mL/瓶） 0 ppb? 0.05 ppb? 0.15 ppb  0.45 ppb  1.35 ppb  4.05 ppb 3．抗体工作液???????????????? 7 mL 3．酶标记物????????????????? 12 mL 4．底物缓冲液???????????????  7 mL? 5．底物液　?????????????????  7 mL? 6．终止液???????????????????  7 mL 7．20倍浓缩洗涤液????? ????? 50 mL?? 加蒸馏水后稀释到1000 mL。 ? 四、样本前处理步骤 实验准备：配制60 ％甲醇水溶液（v/v，60：40）和20 ％甲醇水溶液（v/v，20：80）。 注意：请精确配制上述溶液，以免影响检测的准确性。 1 .?脂肪含量低的固体样品（如大米、玉米、小麦和饲料等） 1、称取5 g 粉碎样品于100 mL带塞三角瓶内，准确加入25 mL 60％甲醇水溶液。 2、将加入了甲醇水溶液的样品放入振荡器内（或用手强力振荡），充分振荡3 min后，用滤纸过滤，收集滤液。 3、取滤液2 mL，加入6 mL 20 ％甲醇水溶液，混匀，用whatman 1号滤纸过滤，此为样品待检液。 2．酱油、醋 1、称取5 g样品于25 mL小烧杯中，用10 mL蒸馏水将试样转移到125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。 2、放出下层三氯甲烷层，取5 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60％甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。 3．食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等） 1、称5 g油样于25 mL小烧杯中，用20 mL石油醚或正乙烷分次将试样转移至125 mL分液漏斗中，准确加入25 mL 60％甲醇水溶液溶液，加塞轻轻振摇5 min，静置分层，放出下层60％甲醇水提取液。 2、取提取液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。 4．酒类 1、称取5 g样品于125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。 2、放出下层三氯甲烷层，取5 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60％甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。 5．花生 1、样品去壳粉碎，称取5 g于100 mL具塞三角瓶中。加入25 mL 60％甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚），振摇10 min，用whatman 1号滤纸过滤。 2、收集滤液于125 mL分液漏斗中，静置分层后放出下层60％甲醇水提取液。 3、取提取液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，再用whatman 1号滤纸过滤，此为样品待检液。 6．月饼、桃酥、花生酱等 1、称取5 g粉碎样品于125 mL具塞三角瓶中，准确加入25 mL 60％甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚）加塞震荡10 min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。 2、待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一三角瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3 min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，取10 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60％甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。 7．面粉、饲料浓缩料 1、称取5 g样品于125 mL具塞三角瓶中，准确加入25 mL 60％甲醇水溶液加塞震荡10 min，过滤，收集滤液。 2、吸取10 mL滤液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞振摇3 min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，取10 mL于20 mL蒸发皿中，65 ℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入5 mL 60％甲醇水溶液，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混匀，此为样品待检液。 ? 注意： 1、某些样品待检液(如花生等)久置会影响检测结果的准确性，为保证检测的准确性，样品提取后请即时检测。 2、 若样品待检液不立即检测，请将其存储于棕色玻璃瓶内，2-8 ℃避光保存。 3、 试剂盒在使用前，请将试剂盒内所有试剂放到室内温度（20-25 ℃）进行温度平衡；试剂用完后立即将其放置回2-8 ℃冰箱内保存。 4、 在每个步骤操作时，速度要快，不要将板孔暴露在空气中时间过久，避免酶标板变干。未用完的酶标板需密闭于自封带内，防止受潮且避光保存于2-8 ℃冰箱内。 5、 温育时，需避光，建议将酶标板置于湿盒内(在有盖容器内放置一块平整湿纱布)进行温育。 ? 五、操作步骤： 1．将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2．按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷冻。 3．加标准品/样本50 μL /孔，然后加抗体工作液50 μL /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，室温下环境反应40 min。 4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5． 加入100 μL酶标记物应用液到微孔板中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，室温下反应20分钟。 6．弃去孔中的液体，并在吸水纸上拍干，每孔注满稀释好的浓缩稀释液，轻轻振荡，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复4次。 7．显色：每孔加入底物缓冲液50 μL，再加底物液50 μL，轻轻振荡混匀，室温环境下避光显色10 min。 8．测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处（在20 min内读完数据），测定吸光度值。 ? 六、结果判定 以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉***B1(AFB1)标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉***B1(AFB1)的实际浓度。 ? 七、注意事项 1．室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20-25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。 2．洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3．混合要均匀，洗板要彻底，否则会出现重复性不好的现象。 4．反应终止液为2 M**，避免接触皮肤。 5．将不用的微孔板放进自封袋重新密封 标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 6．不要使用过了有效日期的试剂盒，不要使用不同批号试剂盒中的试剂。 7．显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之，0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。 ? 八、储藏条件和保质期 储藏条件：试剂盒于2-8 ℃?保存，不要冷冻。 保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。