苏丹红ELISA试剂盒详细说明
一、原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法,在微孔条上预包被偶联抗原,样本中的苏丹红和微孔条上预包被的偶联抗原竞争苏丹红抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样本吸光值与其所含残留物苏丹红的含量成负相关,与标准曲线比较可得出相应苏丹红的含量。 ? 二、试剂盒技术指标 试剂盒灵敏度:???????? 0.4ppb 样本定量检测下限 水基质(番茄酱、坛坛乡)?? 0.4ppb 油基质(辣椒油,辣椒酱) ? 0.4ppb 粉末状(辣椒粉)????????  1.0ppb 交叉反应率 苏丹1号 ……………………………………………… 100% 苏丹2号 ……………………………………………… <1% 苏丹4号 ……………………………………………… <1% 对位红 ………………………………………………… 120% 样本回收率 水基质 ……………………………………………… 75±10% 油基质 ……………………………………………… 50±10% 粉末状 ……………………………………………… 65±10% ? 三、?试剂盒组成 1、微量测试孔:96T 2、 标准品液:(1ml/瓶) 0ppb、0.4ppb、3.2ppb、6.4ppb、12.8ppb、25.6ppb 3、 酶标记物?? ?????? 12ml 4、 抗体工作液??????? 7ml 5、 底物缓冲液破????? 7ml 6、 底物液??????????? 7ml 7、 终止液??????????? 7ml 8、 20倍浓缩洗涤液?? 50ml 9、1mg/ml标准品液:(0.2ml) ? 四、样本处理 取1g样品(辣椒面、辣椒油、辣椒酱、番茄酱),加入3 mL**溶液,超声震荡20 min,涡旋混合0.5 min,静置10 min, 3000 r/min离心分离10 min,取上清100 μL用PBST稀释10倍至1 mL,取50 μL进行ELISA测定。 ? 五、操作步骤 1. 将试剂盒从冷藏环境中取出,置于室温(20~26℃)下平衡30min以上,将需用的条板固定于支架,按顺序编号; 2. 洗液配制:将50 mL浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水稀释至1000 mL备用。(或按需量稀释) 3. 标准品的配制:先将试剂盒中的1 mg/mL苏丹红标准品用洗液稀释1000倍,变成1000ng/mL,再用洗液将1000 ng/mL的标准品分别稀释成0.4 ng/mL, 3.2 ng/mL,6.4 ng/mL,12.8 ng/mL,25.6 ng/mL。(现配现用) 4. 在标准品孔中加入50 μL标准品,样品孔加入50 μL待测样品,然后每孔加入50 μL抗体(加入标品和样品时无时间差的影响),轻拍混匀,37℃下孵育30min; 5. 倒出孔中的液体,以试剂盒浓缩洗液稀释20倍后作为洗液,用洗板机洗涤4~6遍;没有洗板机的用户可用300 μL洗液充入各孔中,静置20 s,倒出孔中的液体,将微孔架倒置,在吸水纸上连续拍打3次以上,以保证完全除去孔中的液体,重复操作4~6遍; 6. 每孔加入酶标记物100 μL,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置37℃ 环境中反应20 min ,取出重复洗板步骤。 7. 显色:每孔加入底物缓冲液50 μL,再加底物液50 μL.轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后,置37℃ 环境中反应10 min。 8. 测定:每孔加入终止液50 μL,轻轻振荡混匀.设定酶标仪于450 nm处(建议用双波长450/630 nm 检测,在20 min内读完数据),测定每孔OD 值,根据标准曲线计算样品浓度。 ? 标准样品配制方法: (1)准备5个1 mL瓶子,其中一个加入1000 μL洗液,一个加入700 μL洗液,其余的分别加入500 μL洗液。 (2)在1000 μL洗液瓶子中先吸出25.6 μL的洗液,然后加入25.6 μL的1000 ng/mL标准品,混匀,使其浓度为25.6 ng/mL,作好记号; (3)再从25.6 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中,使其浓度为12.8 ng/mL,混匀,作好记号; (4)再从12.8 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中,使其浓度为6.4 ng/mL,混匀,作好记号; (5)再从6.4 ng/mL的瓶子中吸出500 μL加入其中一个500 μL洗液的瓶子中,使其浓度为3.2 ng/mL,混匀,作好记号; (6)再从3.2 ng/mL的瓶子中吸出100 μL加入其中一个700 μL洗液的瓶子中,使其浓度为0.4 ng/mL,混匀,作好记号。 (加样前应将标准品充分混匀,配好后在半小时内使用) ? 七、?结果判定 以标准品百分吸光率为纵坐标,以苏丹红标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中苏丹红实际浓度。 ? 八、?注意事项 1.室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。 2.洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3.混合要均匀,洗板要彻底,否则会出现重复性不好的现象。 4.反应终止液为2M**,避免接触皮肤。 5.将不用的微孔板放进自封袋重新密封 标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。 6.不要使用过了有效日期的试剂盒,不要使用不同批号试剂盒中的试剂。 7.显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之,0标准的吸光度值小于0.6时,表示试剂可能变质。 8.该试剂盒比较好反应温度为25 ℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。 ? 九、储藏条件和保质期 储藏条件:试剂盒于2-8℃保存,不要冷冻。 保 质 期:该产品有效期为1年,生产日期见包装盒。